冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

1、冰凍切片固定

冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘，控干水分，置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動洗滌3次，每次5分鐘。

2、抗原修復(fù)

將切片浸沒在升滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盆中，置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)條件：中火8min至沸——?；?min保溫——中低火7min（整個(gè)過程需防止修復(fù)液過度蒸發(fā)，切勿干片。

自然冷卻后，將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上，晃動洗滌3次，每次5min。

3、畫圈血清封閉

切片稍甩干后，用組化筆在組織周圍畫圈，滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑A液，室溫孵育30min，純水洗5分鐘，接著滴加BSA牛血清白蛋白，封閉30min。

4、加一抗

輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。

5、加二抗

切片浸沒在PBS緩沖液中，然后在搖床上，晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加熒光二抗，覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

6、DAPI復(fù)染細(xì)胞核

切片浸沒在PBS緩沖液中，晃動洗滌3次，每次5min。甩干后，在圈內(nèi)滴加即用型DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、淬光組織自發(fā)熒光

切片置于PBS緩沖液中，晃動洗滌3次，每次5min。在圈內(nèi)滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑B液，避光室溫孵育5min，水洗10min。

8、封片

切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，推薦使用遠(yuǎn)慕生物配套試劑、耗材、儀器，實(shí)驗(yàn)效果更佳！

冰凍切片免疫熒光結(jié)果判讀：

DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光或綠光等。