［原理］

在動(dòng)物胰臟中除了存在胰蛋/白酶外，還有另外兩種與胰蛋/白酶性質(zhì)相似的蛋白水解酶：胰凝乳/蛋白酶和彈性蛋白酶。在胰蛋/白酶提取過程中，三者彼此很難分開。需采用合適的方法進(jìn)一步分離純化。

從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋/白酶，一般是用稀酸將胰腺細(xì)胞中含有的胰蛋/白酶原提取出來，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理將提取液的pH值調(diào)至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出來。經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋/白酶原、胰凝乳/蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀。沉淀物經(jīng)水溶解并調(diào)至pH8.0，用極少量的胰蛋/白酶將胰蛋/白酶原激活，同時(shí)溶液中的胰凝乳/蛋白酶原和彈性蛋白酶原也被激活，三種酶原相互作用過程如下：

也可采用從胰臟中提取出胰蛋/白酶原，利用合適的提取溶液的pH值促使胰蛋/白酶原部分自溶，并通過溶液中Ca2+的環(huán)境，使胰蛋/白酶原被開始自溶的少量具有活性的胰蛋/白酶所激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘囊鹊?白酶（胰凝乳/蛋白酶原及彈性蛋白酶原亦同時(shí)被胰蛋/白酶激活成有活性的酶）。

激活后的酶溶液再進(jìn)一步分離純化。

［試劑和器材］

1、試劑

（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液

（2）10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸

（3）2mol/L硫酸

（4）固體硫酸銨

（5）無水CaCl2

（6）結(jié)晶胰蛋/白酶

（7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)

（8）95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇

（9）5mol/Ｌ NaOH

（10）丙/酮

2、器材

（1）胰臟

（2）組織搗碎機(jī)

（3）離心機(jī)

（4）磁力攪拌器

（5）透析袋、20目篩網(wǎng)、紗布、水浴鍋

（6）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃漏斗

（7）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計(jì)、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH試紙等

［方法和步驟］

方法一

1、 胰蛋/白酶原的提取

取新鮮胰臟約150g，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重100g，切成碎塊，在組織搗碎機(jī)中搗碎，并加入2倍體積預(yù)冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成勻漿。漿液倒入500mL燒杯中，用10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸調(diào)節(jié)pH在2.5～3.0之間，在5～10℃下提取6h以上，并間隙輕輕攪拌。用4層紗布過濾，盡量擠出濾液。組織殘?jiān)性偌尤?.5倍體積（約50mL左右）預(yù)冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4層紗布過濾。合并兩次濾液，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液pH在2.5～3.0之間，4℃放置4h（pH始終保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折疊濾紙于玻璃漏斗中自然過濾，收集濾液，量取體積（約200mL左右）。

濾液中加入粉末狀固體硫酸銨，使溶液達(dá) 0.75飽和度（每升濾液加492g，5℃）。放置過夜，使胰蛋/白酶原*析出。次日抽濾，棄濾液，壓緊并收集濾餅，即胰蛋/白酶原粗品。

2、 胰蛋/白酶原的激活

將胰蛋/白酶原粗品稱重（濕重），分次加入10倍體積預(yù)冷的蒸餾水（按濾餅重量計(jì)算），使濾餅*溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重1/4）。用5mol/L NaOH將溶液調(diào)至pH8.0，慢慢地?cái)嚢柘录尤牍腆w無水CaCl2使溶液的Ca2+終濃度達(dá)到0.1mol/L（要減去一部分氯化鈣與硫酸銨結(jié)合生成硫酸鈣的鈣離子）。取出2mL溶液用于測定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg結(jié)晶胰蛋/白酶，輕輕攪拌均勻，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋/白酶原活化。每隔1h取樣測定胰蛋/白酶活性增長情況，直至酶激活速度變慢或停止增長。一般比活可達(dá)到3 500～4 000 BAEE單位/mg。留取2mL溶液用于測定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性。激活酶溶液用2mol/L硫酸調(diào)pH至 2.5～3.0，濾紙過濾，濾去硫酸鈣沉淀，收集濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法二

稱取冷凍豬胰臟100g，在2～5℃下解凍，切成小塊，用組織搗碎機(jī)中絞碎成胰漿，在5～10℃存放24h以上，使胰/酶自身活化。胰漿中加入25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加 0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2），搗碎機(jī)中搗碎1min。胰漿倒入500mL燒杯中，間隙攪拌，溫度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于測定激活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性。

活化反應(yīng)結(jié)束后，胰漿 3 500 r/min離心20min，將離心后上清液用二層紗布過濾。濾液置250mL燒杯中，以過濾清液的體積為準(zhǔn)，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使溶液硫酸銨飽和度為20%。放置 6h后，3 500 r/min離心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分別用適量95%乙醇洗滌過濾，再用丙酮洗滌，過濾。最后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋/白酶粗品Ⅰ。

在上述離心上清液中，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使上清液溶液達(dá)到55% 硫酸銨飽和度，放置 6h后，3 500 r/min離心30min，取離心沉淀，分別用適量95%乙醇、丙酮洗滌，過濾后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋/白酶粗品Ⅱ。