提高抗體純化效率一方面可以通過優(yōu)化現(xiàn)有純化工藝設(shè)備、方法和工藝，挖掘現(xiàn)有純化技術(shù)的潛力。另一方面則可以通過開發(fā)創(chuàng)新性的介質(zhì)和工藝，從根本上突破現(xiàn)有技術(shù)障礙。
 

　　抗體分離純化的主要目的是將抗體與工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)分離，最終獲得高純度、低潛在危害的抗體藥物。
 

　　純化過程中需要去除的工藝相關(guān)雜質(zhì)包括細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、宿主細胞核酸及培養(yǎng)基與加料液成分，需去除的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)主要包括抗體片段和聚集體。純化過程還需具備足夠的病毒滅活去除能力，以去除宿主細胞自身表達的內(nèi)源病毒樣顆粒和未及時發(fā)現(xiàn)的外源病毒。
 

　　大多數(shù)工藝利用ProteinA來捕獲抗體，并利用了至少1個離子交換層析作為精純步驟，僅少數(shù)工藝使用了疏水、羥基磷灰石和分子篩層析等步驟。
 

　　圖1中顯示了一個常見的抗體純化工藝。反應器收獲液首先經(jīng)過離心和過濾，去除細胞和細胞碎片，然后經(jīng)過ProteinA層析捕獲抗體,捕獲后的抗體經(jīng)低pH孵育后，通過兩個離子交換層析進行精純,然后進行病毒過濾，最后換液并調(diào)整抗體濃度，得到抗體原液。
 

　　工藝中的低pH孵育和病毒過濾是兩個正交的專屬病毒去除滅活步驟。這兩個專屬步驟與層析步驟一起，可大大降低原液中可能存在的病毒數(shù)目。
 

　　第一話 離心、過濾
 

　　抗體為胞外分泌型表達，純化的第一步是將培養(yǎng)液上清與細胞及細胞碎片分離開來。在實驗室規(guī)模，分離可通過簡單批次離心完成，但大規(guī)?？贵w生產(chǎn)主要采用連續(xù)分離的方法，主要包括深層過濾、切向流過濾和連續(xù)流離心。
 

　　深層過濾的優(yōu)點是簡單易用，前期投入低。深層過濾介質(zhì)的孔徑分布較廣，內(nèi)表面積大，可依靠孔徑截留和內(nèi)表面吸附雙重作用去除固體顆粒，比單一孔徑濾器能處理更大量的固體雜質(zhì)，且流速更快。
 

　　深層過濾系統(tǒng)由一系列的濾器組成，介質(zhì)的孔徑從上游到下游遞減(見圖2)。深層過濾本身不能達到無菌過濾，所以過濾系統(tǒng)的最后一級通常需要一個無菌濾器。深層過濾介質(zhì)中含有硅藻土，硅藻土在抗體純化條件下帶正電荷，在去除細胞和細胞碎片的情況下，還可以去除部分帶負電荷的宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質(zhì)，起到初步純化的作用。
 

　　深層過濾的缺陷是一次性濾芯使用費用高和處理量有限，在處理大體積培養(yǎng)液時需并聯(lián)多個濾器，費用和占地面積顯著增加，所以深層過濾的試用范圍限于100-2000L的中試規(guī)模的抗體純化。
 

　　切向流濾器在灌流反應器部分較為常用(見圖3)，其高切向的流速可減少細胞在膜表面的沉積，從而可以處理大體積細胞培養(yǎng)液而不造成膜的堵塞。
 

　　切向流的流速越高，細胞沉積越少，但同時帶來的剪切力越高，細胞破碎風險越大。細胞破碎形成的細胞碎片更容易阻塞濾芯，并且細胞破碎釋放的胞內(nèi)蛋白和核酸將大大增加后續(xù)純化步驟的壓力。
 

　　切向流濾器的使用以中空纖維最為普遍，其表面積大，又可以在孔腔內(nèi)形成高剪切力。中空纖維濾器的工藝放大可通過增加纖維數(shù)目完成，簡單易行。
 

　　在切向流過濾工藝開發(fā)和優(yōu)化方面，需要考慮的包括濾芯化學成分、濾芯表面積、孔徑、切向流流速、跨膜壓力。
 

　　切向流過濾存在死體積，可在過濾后期加人少量緩沖液，降低死體積中的抗體含量，減少抗體損失。切向流過濾處理量大，可用于超過10000L細胞培養(yǎng)的分離，達到每小時近5000L的液體處理量。其局限在于濾器費用較高，過濾時間較長，并且過濾速度的可控性低。
 

　　連續(xù)流離心，尤其是采用碟片式離心機進行的連續(xù)流離心，是大規(guī)?？贵w生產(chǎn)中主要采用的分離模式。
 

　　碟片式離心機腔體為錐形，細胞培養(yǎng)收獲液在靠近軸部加入，離心后上清液從軸部附近排出，細胞在離心力作用下，在錐形的底部邊線附近聚集結(jié)塊。
 

　　腔體定期在細胞聚集處輕微開啟，利用腔體內(nèi)的壓力將細胞排出。細胞排出夾帶的液體損失可通過離心力(轉(zhuǎn)速)、腔體開啟頻率和開啟時間的優(yōu)化，控制在5%以下。
 

　　連續(xù)流離心能夠去除絕大部分細胞和細胞碎片。殘留的少量細胞碎片可用深層過濾去除。碟片式離心機的優(yōu)點是體積小，多層碟片形成的沉降面積大，液體處理量大，操作簡單、可靠，使用費用低。其缺點是前期設(shè)備投資髙，清洗較復雜，并缺少合適的小試模型。
 

　　連續(xù)流離心機與沉降器一樣利用細胞與培養(yǎng)基的密度差實現(xiàn)固液分離。圖4顯示的是一個商業(yè)化的碟片式連續(xù)流離心機。細胞培養(yǎng)液自離心機底部進料，在離心力的作用下，細胞在腔體的最外圍富集。
 

　　上下腔體周期性地短暫打開，釋放清除腔體內(nèi)積累的細胞，這部分細胞返回反應器。細胞培養(yǎng)液上清自離心機頂端收獲。連續(xù)流離心分離速度快，液體處理量大，可實現(xiàn)高達3600L/d的灌流速度，細胞分離效果高于90%，有很好的應用前景。
 

　　連續(xù)流離心機的弱點是設(shè)備和操作相對復雜，機械和操作故障風險相對較高。同時離心時形成的細胞團有可能造成局部營養(yǎng)缺失或副產(chǎn)物積累，其程度和影響需進一步考察。連續(xù)流離心機在操作時還需考慮細胞的剪切力耐受性，避免細胞損傷。