DNA載體可使目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以達(dá)到我們的研究目的。

人工改造的 質(zhì)粒是-常用的載體之一，通常具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

1. 有一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，便于目的基因插入；

2. 帶有標(biāo)記基因（抗性基因、熒光基因等），便于篩選；

3. 大小合適（一般小于10kb），便于轉(zhuǎn)染。

載體質(zhì)粒示例：

MCS（multiple cloning site）：多克隆位點(diǎn)外源基因插入；

CMV啟動(dòng)子（以及SV40、bla、T7、U6……）：高效率啟動(dòng)基因表達(dá)；

SV40 polyA信號(hào)（以及TK polyA……)：轉(zhuǎn)錄終止，給mRNA添加polyA尾防降解；

neomycin/kanamycin resistance ORF 新霉素(G418) /卡那霉素抗性 (以及Ampicillin氨芐、puromycin嘌呤霉素……）：用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化/細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的篩選。
 

選擇限制性內(nèi)切酶構(gòu)建載體應(yīng)注意：

1. 單酶切后載體容易自連必須去磷酸化， 不能保證插入片段的方向；

2. 雙酶切需要注意同尾酶的自連。

表達(dá)基因擴(kuò)增的 引物設(shè)計(jì)：

1. NCBI Gene 數(shù)據(jù)庫(kù)查找基因cDNA序列；

2. 查找CDS區(qū)序列的酶切位點(diǎn)，對(duì)比載體上的酶切位點(diǎn)，避免沖突

3. CDS區(qū)首、尾序列+ 5’端加上酶切位點(diǎn)和（或） 保護(hù)堿基

表達(dá)載體構(gòu)建 簡(jiǎn)要流程

1. PCR擴(kuò)增出基因CDS區(qū)，1400bp左右，膠回收；

2. 雙酶切膠回收產(chǎn)物及載體，膠回收；

3. 酶切后的產(chǎn)物用T4連接酶(Takara) 連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化，鑒定。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 引物特異性不好，PCR雜帶太多或根本擴(kuò)增不出來(lái)

在CDS區(qū)的上下游重新選擇引物，擴(kuò)增成功后，以這個(gè)大一點(diǎn)的片段為模板擴(kuò)增CDS區(qū)；

人基因ORF庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。

2. PCR產(chǎn)物酶切不成功

構(gòu)建克隆載體，再酶切；

載體自連會(huì)使Lac Z編碼，在IPTG/X-Gal平板上呈現(xiàn)藍(lán)色。

3. 沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)

無(wú)縫克隆試劑盒。

4. 沒(méi)有合適的抗體

加上標(biāo)簽，翻譯成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；

引物設(shè)計(jì)：CDS區(qū)序列，5’端依次加上標(biāo)簽序列、酶切位點(diǎn)和（或）保護(hù)堿基；

載體自帶標(biāo)簽，需要注意酶切位點(diǎn)處可能移碼。

點(diǎn)突變質(zhì)粒

1. 使用高保真酶進(jìn)行定點(diǎn)突變：PrimeSTAR Max DNA polymerase

PCR合成突變質(zhì)粒，DpnI消化模板質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，后續(xù)測(cè)序鑒定。

2. 使用無(wú)縫克隆連接進(jìn)行定點(diǎn)突變：

PCR擴(kuò)增出突變的線性化載體，無(wú)縫克隆連接成環(huán)狀質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，后續(xù)測(cè)序鑒定。

原理提要

1. 切割區(qū)的選擇在于PAM序列-NGG；

2. 特異性在于sgRNA的20個(gè)堿基；

3. Cas9失活：D10A、H840A突變。

sgRNA設(shè)計(jì)

1. NGG序列前面，長(zhǎng)度20nt左右；

2. GC含量在40-60%之間；

3. 盡量以G堿基開(kāi)始，后7個(gè)堿基的靶向性要好；

4. 盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，第一或第二外顯子。

CRISPR/Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建

1. 線性化載體；

2. sgRNA雙鏈結(jié)合；

3. sgRNA與載體連接；

4. 菌P鑒定。

基因敲除效果鑒定

1.Western檢測(cè)蛋白表達(dá)量；

2.雙sgRNA敲除，間隔200-500bp左右。鑒定引物設(shè)計(jì)在兩個(gè)gRNA外側(cè)。