什么是內(nèi)毒素？

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LipopolySaccharide,LPS）和蛋白的復(fù)合物，當(dāng)細(xì)菌裂解時(shí)便會(huì)大量釋放出來(lái)。內(nèi)毒素單位為EU。

內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)的影響

內(nèi)毒素存在極大程度地影響轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)內(nèi)毒素還可能激活免疫細(xì)胞的非特異反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)中的假陽(yáng)性。因此，為了保證高轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染細(xì)胞高存活率，必須從質(zhì)粒制備的過(guò)程中將內(nèi)毒素去除。

內(nèi)毒素和質(zhì)粒的關(guān)系

由于內(nèi)毒素兩親性和負(fù)電荷性，性質(zhì)類似于DNA，因此在質(zhì)粒純化中會(huì)伴隨質(zhì)粒一同被純化出來(lái)。質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量的高低常用EU/µg質(zhì)粒表示。

按照EU/µg大小，質(zhì)粒被分為三個(gè)級(jí)別：測(cè)序級(jí)別（>50EU/µg）、轉(zhuǎn)染級(jí)別(<50EU/µg)和無(wú)內(nèi)毒素級(jí)別(<0.1EU/µg)。

再次強(qiáng)調(diào)

當(dāng)你提取的質(zhì)粒DNA是為了轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或者敏感細(xì)胞；進(jìn)行基因沉默研究、細(xì)胞注射顯微操作；進(jìn)行基因治療或者DNA疫苗等要求極為嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，就應(yīng)該考慮Endotoxin-Free的質(zhì)粒。

2017年3月，張鋒課題組在《Nature Protocols》發(fā)表的《Genome-scaleCRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening》中，Endotoxin-Free的質(zhì)粒獲得被列為 Critical Step，同時(shí)推薦該廠家的NucleoBond Endotoxin Free Plasmid DNA kit，可避免病毒包裝和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中減少了內(nèi)毒素殘留的影響。