慢病毒是當(dāng)前熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。然而仍有一部分細(xì)胞，尤其是原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞由于細(xì)胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細(xì)胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑，然而細(xì)胞狀態(tài)卻變差了，且增加感染效率并沒有達(dá)到理解的效果，這是什么原因呢？
 
一、對慢病毒感染出現(xiàn)的問題進(jìn)行原因分析

1. 細(xì)胞狀態(tài)變差——細(xì)胞毒性 
 

• 雜質(zhì)：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素及宿主細(xì)胞DNA等是造成細(xì)胞毒性的主要因素。特別對于某些外源刺激敏感的細(xì)胞來說，嚴(yán)重時將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這是病毒感染細(xì)胞后，狀態(tài)差異的主要原因。
• 過度感染：外源基因過度表達(dá)，會導(dǎo)致目的細(xì)胞本身正常新陳代謝失衡。這是有些細(xì)胞過感會死亡的主要原因。

2. 病毒加了不少，效果不理想，如何增加感染效率——了解影響慢病毒感染效率的因素
 

• 細(xì)胞膜的流動性
• 細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)豐度
• 病毒與細(xì)胞的接觸面積和接觸幾率
• 細(xì)胞膜與病毒外殼蛋白電荷的多少

 
二、如何有針對性地增加慢病毒感染效率

了解了影響細(xì)胞狀態(tài)和感染效率的原因后，我們就可以有針對性的進(jìn)行調(diào)整。吉凱基因從大量的文獻(xiàn)及實(shí)際操作中總結(jié)了增加感染效率的方法，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選擇性的使用：
 
1.  使用高滴度高純度的慢病毒，可以減少病毒中的雜質(zhì)對細(xì)胞狀態(tài)的影響：降低慢病毒對細(xì)胞的毒性
2.  調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，感染時使用對數(shù)期的細(xì)胞：增加細(xì)胞膜的流動性
3.  降低感染時血清濃度，使用無血清/低血清的培養(yǎng)基：降低血清蛋白對病毒外殼蛋白的封閉
4.  離心法，感染時將細(xì)胞培養(yǎng)板密封，用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)：增加慢病毒與細(xì)胞的接觸幾率，但對細(xì)胞有一定的機(jī)械損傷，儀器要求高
5.  感染時加入Rentronectin等纖粘蛋白：增加慢病毒與細(xì)胞接觸幾率，但會影響細(xì)胞的貼壁狀態(tài)
6.  使用傳統(tǒng)的助感染試劑，如Polybrene：中和細(xì)胞膜和病毒粒子之間的電荷排斥，但Polybrene本身就具有細(xì)胞毒性，部分細(xì)胞對Polybrene敏感，容易導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡。
7.  使用相比Polybrene，可顯著提高細(xì)胞感染效率，且對細(xì)胞毒性極低，更適合敏感細(xì)胞使用
 
三、特殊細(xì)胞慢病毒感染注意事項(xiàng)

1. 懸浮細(xì)胞
    對于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染方法提高感染效率。如將細(xì)胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
 
2. 極難感染的細(xì)胞
    對于極難感染的細(xì)胞，可采用多次感染的方法，即感染一次后，重新加入新鮮病毒再次感染，可顯著提升感染效率。但需要注意調(diào)整兩次感染間細(xì)胞狀態(tài)。
 
3. 傳代能力較差的原代細(xì)胞、非分裂細(xì)胞
    原代細(xì)胞：由于細(xì)胞增長緩慢，可以在接種時提高匯合度到50%～60%，確保在感染后4天時細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%；
    非分裂細(xì)胞：如神經(jīng)元細(xì)胞，接種后不再增殖，需要按照100%的匯合度進(jìn)行接種。