關(guān)鍵詞：染色 脂蛋白 核酸蛋白質(zhì) 染色脂蛋白染色、核酸染色 醋酸纖維 瓊脂糖 聚丙烯酰胺電泳

染色方法詳詢—上海遠(yuǎn)慕生物

（以下方法介紹僅參考！注：本公司產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)?。?/span>

經(jīng)醋酸纖維、瓊脂(糖)、聚丙烯酰胺電泳分離的各種生物分子需用染色法使其在支持物相應(yīng)位置上顯示出譜帶，從而檢測其純度、含量及生物活性。蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法，現(xiàn)分別介紹如下：

一、蛋白質(zhì)染色

染色液種類繁多，各種染色液染色原理不同，靈敏度各異。使用時(shí)可根據(jù)需要加以選擇。常用的染色液有：

1．氨基hei10B(amino black 10B又稱為amidoschwarz 10B或naphthalene blueblack，2B 200)氨基hei10B分子式為C22H13N6S3Na3，MW=715，λmax=620-630nm，是酸性染料。其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是zui常用的蛋白質(zhì)染料之一，但對SDS-蛋白質(zhì)染色效果不好。另外，氨基hei10B染不同蛋白質(zhì)時(shí)，著色度不等、色調(diào)不一(有藍(lán)、黑、棕等)；作同一凝膠柱的掃描時(shí)，誤差較大。

2．考馬斯亮藍(lán)R250(coomassie brilliant blue R250，簡稱CBBR250或PAGE blue83)

考馬斯亮藍(lán)R250的分子式為C14H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560-590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。該染料是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋白質(zhì)濃度超過一定范圍時(shí)，對高濃度蛋白質(zhì)染色不合乎Beer定律，作定量分析時(shí)要注意這點(diǎn)。

3．考馬斯亮藍(lán)G250(簡稱CBBＧ250或PAGE blue G90，又名xylene brilliant cyanin G)

考馬斯亮藍(lán)G250比CBB R250多二個(gè)甲基。MW=854，λmax=590-610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點(diǎn)是在三lv乙酸中不溶而成膠體，能選擇地使蛋白質(zhì)染色而幾乎無本底色，所以常用于重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。

4．銀染色法

此法是Switzer.R.C和Merril.CR首先提出的，它較CBB R250靈敏100倍。但染色機(jī)制

尚不清楚，可能與攝影過程Ag+的還原相似。其靈敏度很高，牛血清為4×10-5μg/mm2，即清蛋白為8×10-5μg/mm2，cyt C為1.7×10-4μg/mm2，因此也常用于凝膠電泳蛋白質(zhì)染色。

二、脂蛋白染色

1．油紅O（oil red）染色

將凝膠先置于平皿中，用5%乙酸固定20min，用H2O漂洗吹干后，再用油紅O應(yīng)用液染色18h，在乙醇∶水=5∶3中浸洗5min，zui后用蒸餾水洗去底色。必要時(shí)可用氨基黑復(fù)染，以證明是脂蛋白區(qū)帶。

2．蘇丹heiB（sudan black B）

將2g蘇丹heiB加60ml吡啶和40ml醋酸酐、混合，放置過夜。再加3000ml蒸餾水，乙酰蘇丹黑即析出。抽濾后再溶于丙酮中，將丙酮蒸發(fā)，剩下粉狀物即乙酰蘇丹黑。將乙酰蘇丹黑溶于無水乙醇中，使呈飽和溶液。用前過濾。按樣品總體積1/10量加入乙酰蘇丹黑飽和液將脂蛋白預(yù)染后進(jìn)行電泳。此染色適用于瓊脂糖電泳及PAGE脂蛋白的預(yù)染。

三、核酸的染色

核酸染色法一般可將凝膠先用三lv乙酸、甲酸—乙酸混合液、lv化高汞、乙酸、乙酸鑭等固定，或者將有關(guān)染料與上述溶液配在一起，同時(shí)固定與染色。有的染色液同時(shí)染DNA及RNA，如stains-all、溴乙錠、掊花青-鉻礬法等，也有RNA、DNA各自特殊的染色法。

1．RNA染色法

(1)熒光染料溴乙錠(ethidium bromide簡稱EB)：可用于觀察瓊脂糖電泳中的RNA、DNA帶。EB能插入核酸分子中堿基對之間，導(dǎo)致EB與核酸結(jié)合。超螺旋DNA與EB結(jié)合能力小于雙鏈開環(huán)DNA，而雙鏈開環(huán)DNA與EB結(jié)合能力又小于線性DNA，可在紫外分析燈(253nm)下觀察熒光。如將已染色的凝膠浸泡在1mmol/L MgSO4溶液中1h，可能降低未結(jié)合的EB引起的背景熒光，對檢測極少量的DNA有利。EB染料具有下列優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，凝膠可用1-0.5μg/ml的EB染色，染色時(shí)間取決于凝膠濃度，低于1%瓊脂糖的凝膠、染15min即可。多余的EB不干擾在紫外燈下檢測熒光；染色后不會(huì)使核酸斷裂，而其他染料做不到這點(diǎn)，因此可將染料直接加到核酸樣品下，以便隨時(shí)用紫外燈追蹤檢查；靈敏度高，對1ng RNA、DNA均可顯色。EB染料是一種強(qiáng)烈的誘變劑，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，應(yīng)戴上聚乙烯手套。

(2)焦寧Y(pyronine Y)：此染色料對RNA染色效果好，靈敏度高。TMV-RNA在2.5%PAAG，直徑為0.5cm的凝膠柱中檢出的靈敏度為0.5μg；若選擇更合適的PAAG濃度，檢出靈敏度可提高到0.01μg；脫色后凝膠本底顏色淺而RNA色帶穩(wěn)定，抗光且不易退色。

2．DNA染色法

除了用EB染色外，還有以下幾種方法：

(1)甲基綠(methyl grenn)：一般將0.25%甲基綠溶于0.2mol/L pH4.1的乙酸緩沖液中，用lv仿抽提至無紫色，將含DNA的凝膠浸入，室溫下染色1h即可顯色，此法適用于檢測天然DNA。
(2)二苯胺(diphenylamine):DNA中的α—脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑染色1h，再在沸水浴中加熱10min即可顯示藍(lán)色區(qū)帶。此法可區(qū)別DNA和RNA。